Résumé
Une méthode analytique entièrement automatisée et véritablement écologique, pour une analyse des pesticides de haute sensibilité et précision.
Ce rapport décrit pour la première fois un flux de travail entièrement automatisé d'extraction et de purification QuEChERS pour des matrices homogènes comme les jus de fruits, illustré ici avec du jus d'orange.
Introduction
Une méthode entièrement automatisée d'extraction et de purification d'extrait QuEChERS pour l'analyse GC-MS et LC-MS est présentée à l'aide d'un système d'échantillonnage robotisé PAL RTC. QuEChERS est la procédure d'extraction de pesticides bien établie, rapide, facile, économique, efficace, robuste et sûre, développée par M. Anastassiades et S.J. Lehotay en 2003¹ et devenue une approche de préparation d'échantillons largement utilisée dans les analyses de résidus de pesticides.
Les étapes de l'analyse des résidus de pesticides commencent par l'échantillonnage représentatif et le prétraitement par broyage, les étapes manuelles nécessaires pour obtenir un sous-échantillon homogène en vue du traitement. Les jus de fruits et légumes sont considérés comme homogènes après avoir bien agité leur emballage commercial, bouteilles ou briques, avant de prélever un aliquot pour analyse.
0,5 mL de jus homogénéisé sont transférés dans un flacon standard de 2 mL pour échantillonneur automatique, en vue de l'extraction automatisée, de la purification et de l'analyse en ligne par LC-MS ou GC-MS.
La purification de l'extrait brut et l'élimination de la matrice sont réalisées à l'aide de cartouches micro-SPE (μSPE). L'avantage de la μSPE réside dans la séparation directe de la fraction pesticide de la matrice par élution à travers un fin lit de sorbant, la matrice restant piégée.
Cette méthode de micro-extraction évite totalement l'évaporation du solvant, préservant ainsi la concentration initiale des pesticides et garantissant des taux de récupération élevés. Le processus automatisé d'extraction et de purification ne prend que quelques minutes et est parfaitement compatible avec les durées d'analyse chromatographique. Un mode de préparation anticipée permet de traiter l’échantillon suivant pendant l'analyse chromatographique du précédent.
Configuration du système PAL
Un système PAL RTC avec changement d'outil automatisé a été utilisé. La configuration du système, illustrée à la figure 1, comprend en outre un agitateur vortex, des modules de solvant et de lavage, ainsi qu'un porte-plateau avec les supports pour les flacons d'échantillon et d'extrait, et les cartouches de purification micro-SPE.
Pour l'extraction automatisée QuEChERS, une solution saturée de NaCl est fournie dans le module de solvant. L'acétonitrile pour l'extraction est fourni par un module de lavage rapide à partir d'un réservoir externe.
Le flux de travail inclut l'ajout d'étalons internes et de protecteurs d'analytes (PA) optionnels, ainsi que la préparation automatisée de la gamme d'étalonnage des pesticides à partir d'étalons de référence. Le même support pour flacons contient les flacons d'échantillon, des flacons vides pour recueillir l'extrait purifié, ainsi que les cartouches μSPE nécessaires à la purification, comme illustré sur la figure 2.
Figure 1. Configuration du système PAL RTC pour l'extraction automatisée QuEChERS et le nettoyage des échantillons de jus.
Figure 2. Vue de dessus du porte-plateau montrant le positionnement des étalons, des échantillons, des extraits purifiés et du réservoir de la cartouche μSPE.
Flux de travail automatisé
L'analyse automatisée des pesticides dans les jus comprend cinq étapes :
• Préparation des solutions étalons
• Ajout des étalons
• Extraction à l'acétonitrile
• Purification de l'extrait
• Injection et analyses GC-MS et/ou LC-MS
La première étape, avec la préparation d'une nouvelle courbe d'étalonnage, est optionnelle, de même que l'ajout d'étalons internes à l'échantillon. Généralement, des solutions étalons multi-résidus commerciales de pesticides sont utilisées. La dilution des étalons est effectuée de manière routinière en saisissant les facteurs de dilution souhaités.
Le flux de travail automatisé d'extraction et de purification jusqu'à l'injection GC-MS est illustré sur la figure 3.
L'étape d'extraction QuEChERS est réalisée par agitation intense au vortex dans les conditions initiales de relargage à forte concentration de NaCl. Un ajustement du pH selon les méthodes AOAC 2007.01 ou EN 15662 peut être réalisé en fournissant les sels tampons requis dans des flacons préparés à cet effet avant l'ajout d'un échantillon de jus. La purification de l'extrait est réalisée en appliquant l'extrait brut après séparation de phases sur des cartouches μSPE. Ici, la seringue fonctionne comme une pompe LC, elle pousse l'extrait à un débit lent et constant de 2 μL/s à travers la cartouche. La fraction de pesticides est éluée en premier, laissant la matrice de l'échantillon sur la cartouche. L'extrait purifié est recueilli dans des flacons vides placés sur le même porte-flacons.
La composition du sorbant de la cartouche de purification est optimisée pour les analyses GC-MS et LC-MS². Un avantage majeur de cette composition optimisée, du point de vue logistique, réside dans la grande polyvalence des cartouches pour tout type d'échantillons alimentaires. Ceci inclut également les échantillons à forte teneur en matières grasses et contenant des épices, rendant inutile toute modification supplémentaire de la composition du sorbant pour différents types de matrices³,⁴.
En configuration GC-MS/LC-MS en ligne, chaque échantillon est traité simultanément en 5 à 7 minutes. Un mode dit « préparation anticipée » permet le traitement de l’échantillon suivant pendant l’analyse de l’échantillon précédent, comme illustré ci-dessous. Ce mode augmente considérablement le débit d’échantillons et optimise l’utilisation du système d’analyse associé. Le flux de travail décrit ici s’intègre aux systèmes d’acquisition de données chromatographiques Agilent pour la GC-MS et la LC-MS.
Extraction QuEChERS
- Ajouter 500 µL de jus dans des flacons de 2 mL
- Placer les flacons bouchés dans le portoir d’échantillons n°1
- Sélectionner l’outil µSPE avec une seringue de 1000 µL
- Ajouter 600 µL de MeCN à l’échantillon de jus
- Ajouter 250 µL de NaCl saturé à l’échantillon de jus
- Vortexer le flacon
- Nettoyer la seringue avec du MeCN
- Attendre la séparation des phases
- Conditionner la cartouche µSPE (optionnel)
- Aspirer l’extrait QuEChERS
- Charger la cartouche µSPE
- Nettoyer la seringue avec du MeCN
- Éluer la cartouche µSPE dans le portoir n°2
- Jeter la cartouche
- Nettoyer la seringue avec du MeCN
Nettoyage µSPE
- Sélectionner l’outil liquide avec une seringue de 25 µL
- Nettoyer la seringue avec le solvant d’élution
- Ajouter le protecteur d’analyte à l’extrait nettoyé
- Ajouter l’étalon interne à l’extrait nettoyé
- Mélanger avec la seringue dans le flacon d’extrait
- Nettoyer la seringue avec du MeCN
Analyse GC-MS
- Sélectionner l’outil liquide avec une seringue de 10 µL
- Nettoyer la seringue avec du MeCN
- Vérifier le signal GC (prêt)
- Rincer la seringue avec l’extrait nettoyé
- Aspirer 2 µL d’extrait
- Injecter dans l’injecteur GC
- Démarrer le GC
- Nettoyer la seringue avec du MeCN
Cycle suivant
Expérimental
La seule étape manuelle du projet consistait à transférer le jus d'orange de la bouteille préalablement agitée dans des flacons d'échantillon de 2 mL.
Les étapes d'extraction QuEChERS suivantes, telles que l'ajout d'acétonitrile, l'ajout de chlorure de sodium saturé, la purification et l'injection dans le GC-MS/MS, sont toutes réalisées par le système PAL RTC à l'aide du logiciel CHRONOS pour construire le flux de travail automatisé.
Paramètres d’analyse
Échantillonneur robotisé PAL RTC
Volume de l'échantillon : 400 µL
Volumes des solutions étalons : 50 µL chacune (pour l'étalonnage et l'étalon interne)
Volume de MeCN : 3 × 200 µL (solvant d'extraction)
Salting out : 200 µL (solution saturée de NaCl)
Vitesse et durée d'agitation : 1 500 tr/min, 60 s
Purification de l'extrait : 250 µL d'extrait brut (appliqués sur la μSPE)
Débit de purification : 2 µL/s
Conditions GCMS
Température d'injection : 250 °C
Mode d'injection : splitless
Volume d'injection : 3 µL
Colonne : SH-Rxi-5Sil MS, 30 m × 0,25 µm × 0,25 mm
Température du four : 50 °C (2 min),
30 °C/min jusqu'à 75 °C (1 min),
4 °C/min jusqu'à 250 °C (1 min),
20 °C/min jusqu'à 300 °C (0,92 min)
Paramètres MS
Température de la source d'ions : 250 °C
Détection : mode MRM
Résultats et discussion
Pour l'extraction automatisée, la taille de l'échantillon de jus homogène est réduite de 10 g à seulement 400 à 500 μL de jus.
La figure 4 montre l'échantillon de jus d'orange lors des étapes de préparation et de purification de l'échantillon QuEChERS. Après l'ajout de chlorure de sodium saturé, deux phases liquides se forment. Après agitation au vortex et sédimentation, la phase supérieure est l'extrait brut d'acétonitrile. Un aliquot de cet extrait est transférée sur la cartouche μSPE pour purification. L'efficacité de la purification est visible par l'élimination des colorants.
Un groupe de pesticides organophosphorés a été évalué en fonction de l'ajout de standards de pesticides avant et après l'analyse des échantillons de jus. Grâce au logiciel CHRONOS, les étapes de pré-ajout et de post-ajout peuvent être intégrées en option au flux de travail automatisé.
Figure 3. Étapes du flux de travail visualisées dans les flacons de 2 mL pour l'extraction et du nettoyage automatisés du jus. (a) : jus d'orange en brique (b) : jus d'orange + acétonitrile, vortexé (c) : jus d'orange + acétonitrile + NaCl saturé, séparation de phase (d) : Extrait purifié après μSPE, injecté
Chromatogrammes et courbes de calibration
Le chromatogramme ionique total du jus d'orange extrait après extraction automatisée QuEChERS et purification par ajout de standards à 100 ng/mL de composés organophosphorés est présenté sur la figure 4.
La gamme de concentrations a été établie de 1,0 à 100,0 ng/mL, les standards étant ajoutés à un blanc et à un extrait de jus d'orange purifié par μSPE. Une excellente linéarité, avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,995 pour tous les pesticides organophosphorés étudiés, a été obtenue. Les courbes d'étalonnage des composés à élution tardive, le pipéronyl butoxyde, le leptophos et le coumaphos, sont présentées à titre indicatif pour le groupe de composés de la Figure 5. Les données pré- et post-enrichissement de sept analyses consécutives ont été utilisées pour calculer les taux de récupération et les limites de détection (LD) de la méthode, indiqués dans le Tableau 1. Les données obtenues montrent un taux de récupération élevé, compris entre 71 % et 114 %, pour tous les pesticides étudiés. Les LD confirment une très bonne sensibilité de la méthode décrite, conforme à la réglementation. Des chromatogrammes obtenus en conditions réelles, des composés à faible récupération et à élution tardive, au seuil de décision de 10 ng/mL, sont présentés dans la Figure 6.
Figure 4. Chromatogramme TIC du jus d'orange dopé (100 ng/mL) après l'extraction automatisée QuEChERS et le nettoyage μSPE.
Figure 5. Courbes d'étalonnage linéaires dans des extraits de jus d'orange nettoyés par μSPE et dopés des composés à élution tardive, le butoxyde de pipéronyle, le leptophos et le coumaphos.
Figure 6. Chromatogrammes de masse réels (3 transitions MRM chacune) à 10 ng/mL, (a) ajout de 10 ng/mL, (b) essai à blanc.
Tableau 1. Linéarité, précision, rendement et limites de détection de la méthode des pesticides organophosphorés étudiés extraits automatiquement du jus d'orange.
Conclusion
La procédure d'extraction et de purification QuEChERS entièrement automatisée libère des ressources dans le laboratoire. Le système d'échantillonnage PAL RTC qui fait figure de standard au laboratoire, offre une méthode fiable pour l'analyse des pesticides dans des échantillons homogènes, comme illustré pour l'analyse des pesticides organophosphorés dans le jus d'orange. La quantité généralement élevée de solvants, de verrerie et de consommables requise pour l'analyse des pesticides est considérablement réduite, offrant ainsi une méthode analytique véritablement écologique.
La méthode automatisée évite les étapes d'évaporation du solvant, utilise un seul type de cartouche pour toutes les matrices et est rapide à exécuter en ligne pendant une analyse chromatographique en mode « préparation anticipée », optimisant ainsi le débit d'échantillons du système de détection MS utilisé.
Les données analytiques montrent une excellente sensibilité pour les pesticides organophosphorés étudiés, avec des limites de détection (LD) dans la gamme de concentrations est de 3 à 4 ng/mL. L'étalonnage quantitatif est linéaire dans la gamme de 1 à 100 ng/L. La précision de la méthode est excellente, avec un coefficient de variation (CV) inférieur à 10 % pour tous les composés, ce qui fait de cette méthode automatisée une solution parfaitement adaptée à l'analyse des pesticides dans des échantillons de jus homogènes.
Le flux de travail automatisé d'extraction et de purification décrit peut-être appliqué pour l'analyse GC-MS et LC-MS en ligne sans surveillance.
Le texte original de cette étude peut être téléchargé à cette adresse : https://www.chromatographyonli...
Références
1 Anastassiades, M., S.J. Lehotay, D. Stajnbaher and F.J. Schenck. 2003.
“Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extraction/ Partitioning and ‘Dispersive Solid-Phase Extraction’ for the Determination of Pesticide Residues in Produce”. JAOAC Int 86(2) 412-31.
2 Bruce D. Morris and Richard B. Schriner, J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 5107−5119.
3 Steven J. Lehotay, Lijun Han, Yelena Sapozhnikova, Automated Mini-Column Solid-Phase Extraction Cleanup for High-Throughput Analysis of Chemical Contaminants in Foods by Low-Pressure Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, Chromatographia, 13.06.2016, DOI 10.1007/s10337-016-3116-y.
4 Goon A., Shinde R., et al. 2019. “Application of Automated Mini–Solid-Phase Extraction Cleanup for the Analysis of Pesticides in Complex Spice Matrixes by GC-MS/MS”. J. AOAC Int. 103(1) 40–45. DOI https://doi.org/10.5740/ jaoacint.19-0202
5 Chong, C.M., Hubschmann, H.-J. (2021). Fully Automated QuEChERS Extraction and Cleanup of Organophosphate Pesticides in Orange Juice. LCGC Special Issue 04-01-2021 (39) 12–16.